DNA/RNA提取

DNA提取

质粒提取

gDNA提取

RNA提取

RNA提取是分子生物学中的一项基础实验技术，用于从细胞或组织中分离纯化RNA。高质量的RNA是后续如RT-PCR、RNA测序（RNA-seq）、Northern blot等实验的关键

mRNA提取

1.试剂和仪器准备

Materials 耗材试剂 设备

2.试剂成分和提取原理

Dynabeads® mRNA DIRECT™ 试剂盒的优势：
• 快速 — 15分钟的程序即可获得纯净、完整的 mRNA
• 高纯 mRNA 分离 — cDNA 合成上游的理想选择
• 灵敏的 mRNA 分离 — 可实现来自超小起始样品的 cDNA 合成和 cDNA 文库构建（支持从单个细胞构建 cDNA 文库）

Kit成分表
Compoent 容量

Dynabeads Ologo(dT)25

(=5mg/mL, supplied in PBS pH7.4)

 5mL

Lysis/Binding Buffer

  • 100mM Tirs-HCl, pH7.5

  • 500mM LiCl

  • 10mM EDTA, pH 8

  • 1% LiDS

  • 5mM dithiothreitol (DTT)

 30mL

Washing Buffer A

  • 10mM Tris-HCl, pH 7.5

  • 0.15M LiCl

  • 1mM EDTA

  • 0.1% LiDS

 60mL

Washing Buffer B

  • 10mM Tris-HCl, pH 7.5

  • 0.15M LiCl

  • 1mM EDTA

 30mL
10mM Tris-HCl Ph 7.5 (Elution Buffer)

分离方案依赖于在大多数 mRNA 3’ 端 polyA 残基与共价偶联到 Dynabeads® 表面的寡核苷酸 (dT)25 之间的碱基配对。其他缺乏 polyA 尾的 RNA 种类不会与微珠杂交，并且易于洗涤。核糖体 RNA、DNA、蛋白和小 RNA 分子（如转运 RNA、微小 RNA 和小核仁 RNA）不会与珠结合且会被丢弃

Tip

1 mg Dynabeads® 寡核苷酸 (dT)25 微珠 (200µL) 能够结合高达 2 µg mRNA。一个常规的哺乳细胞包含10-30pg的total RNA，1%-5%是mRNA

只有当bead和sample比例合适的时候才不会发生mRNA size的bias，当有大量mRNA或孵育时间过短，beads更倾向于短分子

Beads提取原理

Beads提取原理

3.步骤

开始前准备

Caution
  1. Beads需要涡旋或者移液器打匀进行重悬，并且在室温回温半小时
  2. Lysis/Binding Buffer和Washing Buffers A和B提前放置在室温
  3. 10mM Tris-HCl在使用之前拿出或者放置在2-8度冰浴。
  4. 需要在wash Beads后彻底吸干净buffer，buffer中含有LiDS–具有强烈的酶活抑制
3.1 样本前处理

植物或动物组织需要液氮速冻后，加入裂解液进行离心，做到之后再进行补充

  1. 离心收集细胞(400xg,8min,4度)
标准量 Micro Mini Maxi
1-4x106 <150000 0.15-1 x 106 4-20 x 106

  1. 使用PBS/DPBS重悬细胞，重新离心，清洗细胞。

  2. 按照不同的细胞量添加不同量的培养基

标准量 Micro Mini Maxi
1250µL 300µL 300µL 5mL
  1. 使用移液器多次吹打直到DNA全部释放，得到粘稠的液体
3.2 Dynabeads Oligo(dT)25 准备
  1. 重悬Beads，按照需要的量将Beads转移到1.5mL无核酶离心管中，将离心管放置到磁力架上
Table 1
标准量 Micro Mini Maxi
250µL 10µL 50µL 1mL
  1. 经过30s或者1min后，当溶液变澄清，移除上清液
  2. 将离心管从磁力架上移下来，使用表格 Table 1 中的Lysis/Binding Buffer量清洗beads
3.3 mRNA提取
  1. 将上一步清洗后的beads放置到磁力架上,静置30s或1min，等待beads全部被吸附。
  2. 移除上清液体后，按照 Table 1 加入合适的样品裂解液，移液器重悬beads
  3. 将混合后的beads使用HulaMix或者roller mix进行孵育，3-5min，使得mRNA与beads结合
Important

千万不要用涡旋仪进行混匀，会将mRNA打断

  1. 将孵育后的beads放置到磁力架上2min，如果粘度很多增加到10min左右
  2. 吸去上清之后，室温下加入合适体积的Wash A Buffer ，重复磁力架-吸取上清的步骤
标准量 Micro Mini Maxi
1-2mL 600µL 600µL 10mL
  1. 使用Wash B Buffer 室温下进行清洗，如果分离的mRNA用于后续的酶反应(RT-PCR)，再进行额外一次的wash Buffer B 清洗
标准量 Micro Mini Maxi
1-1.5mL 300µL 300µL 5mL
  1. mRNA解离，按照表中加入合适的洗脱液10mMTris-HCl pH7.5,然后在65°C–80°C孵育2min，立即将beads放到磁力架上，将Elution Buffer吸取放置到冰上
标准量 Micro Mini Maxi
10-25µL 10µL 10µL 50-100µL
3.4 rRNA清除(可选)

在一些情况下提取的mRNA会存在rRNA的污染，对于Northern Blot和RT-PCR是没有干扰的，但是对于cDNA文库的构建和microarray分析rRNA需要被避免

原则上是通过重新分离mRNA去洗脱，重新使用beads是被推荐的，否则新的beads需要使用焦磷酸钠清洗

  1. 按照上述步骤得到洗脱的mRNA
  2. 将洗脱的mRNA转移到新的无核酶1.5mL离心管中放置在冰上，不要扔掉beads
  3. 使用Washing Buffer B清洗两次beads
  4. 使用4倍体积Elution buffer加入Lysis/Binding Bffer(洗脱用20µLbuffer，添加80µL Lysis/Bingding Buffer)
  5. 移除Washing Buffer B，加入上一步稀释好的mRNA
  6. 在室温下，孵育3-5min
  7. 之后进行Washing Buffer A清洗–Washing Buffer B 清洗–洗脱
3.5 RNA定量
试剂 样照
Qubit™ RNA 高灵敏度 (HS)、宽范围 (BR) 和扩展范围 (XR) 定量试剂盒
Qubit3.0
Qubit RNA HS 定量试剂盒

Qubit RNA HS（高灵敏度）定量试剂盒用于准确检测初始浓度为 0.2 至 200 ng/µL 的 RNA 样品（具体取决于样品体积），检测范围为 4−200 ng

Qubit RNA BR 定量试剂盒

Qubit RNA BR（宽范围）定量试剂盒,该定量试剂盒设计用于准确检测初始浓度为 0.5 至 1,200 ng/µL 的 RNA 样品（具体取决于样品量），检测范围为 10−1,200 ng

Qubit RNA XR 定量试剂盒

Qubit RNA XR（扩展范围）定量试剂盒,该定量试剂盒设计用于准确检测初始浓度为 5 至 20,000 ng/µL 的 RNA 样品（具体取决于样品量），检测范围为 100−20,000 ng

  1. 准备样品和标准品，室温下面回温，最好将染料分装。
  2. RNA BR assay需要两个标准品进行校准，耗材是特定的0.5mL PCR tubes
  3. Qubit working solution是 Qubit RNA BR 1：200 稀释在RNA BR Buffer中。
Important

荧光染料，不要在玻璃容器中进行混匀

  1. 添加标准品或样品到buffer mix中，补足200µL体积
标准品测试 样本测试
Volume of working solution 190µL 180–199 µL
Volume of standard 10 µL –
Volume of user sample – 1–20 µL
Total volume in each assay tube 200 µL 200 µL
  1. 涡旋3-5秒
  2. 室温放置孵育2imn，注意避光。
  3. 将PCR管放置到Qubit中，在屏幕上点击Home–touch RNA–选择RNA Broad Range
  4. 按照试剂上的标签，标准品分为#1和#2，先将#1插入Qubit读取，再插入#2插入Qubit读取
Tip
  1. 注意测量方式的选择，不能选错，Qubit分为RNA，dsDNA，ssDNA
  2. 标准品测定要区分数据
  1. 将样品放置到Qubit中，选择上样的量(1-20µL),选择合适的单位之后，进行读取

Total RNA提取

1.仪器和试剂准备

Materials 耗材试剂 设备

2.试剂成分和提取原理

TRIzol 试剂是一种即用型试剂，用于在 1 小时 内从人类、动物、植物、酵母或细菌来源的细胞和组织样本中提取高质量的总 RNA（以及 DNA 和蛋白质）。TRIzol 试剂含有苯酚、异硫氰酸胍和其他特殊组分的单相溶液，可促进提取各种大或小分子量的 RNA。在 TRIzol 试剂进行样本匀浆化的过程中，它可以破坏细胞，溶解细胞组分，同时高效的抑制 RNA 酶的活性，从而维持 RNA 的完整性。TRIzol 试剂可同时处理大量样本，对 Chomcynski 和 Sacchi 开发的一步法提取 RNA（Chomczynski和 Sacchi，1987）的改进

采用 TRIzol 试剂进行样本匀浆化后，加入氯仿，匀浆物可分成透明的上层水相层（含有 RNA）、相界面和红色的下层有机层（含有 DNA 和蛋白质）。然后用异丙醇从水相层中沉淀出 RNA。用乙醇从相界面和有机层中沉淀出DNA。利用异丙醇沉淀从酚 - 乙醇上清液中沉淀出蛋白质。洗涤沉淀的 RNA、DNA 或蛋白质，去除杂质，重悬浮后供下游应用

TRIzol

TRIzol

3.核酸提取

3.1 样品前处理
  • 组织： 每50-100mg组织(可速冻)加入1mLTRIzol试剂，并用匀浆机破碎
  • 单层贴壁细胞
    1. 移除培养基
    2. 使用预冷的DPBS/PBS冲洗一遍细胞，吸取干净。有时候为了避免mRNA降解也不进行清洗。
    3. 加入1mL(可根据细胞量适量减少TRIzol量)TRIzol试剂到培养皿中裂解细胞
    4. 一定要使用移液器反复吹打使用细胞充分裂解
  • 悬浮细胞处理
    1. 通过离心收集细胞并弃掉上清
    2. 由于悬浮细胞量大，向细胞中加入1mLTRIzol
    3. 反复吹打使细胞裂解
Tip
  • 组织或细胞可以放置在-80°C中保存，直到使用前加入TRIzol
  • 也可以加入TRIzol后，样本可以在4°C保存过夜，第二天处理，也可以放在-20°C保存长达一年，-80°C更长时间的保存，标签一定要做好
  • TRIzol味道很大，有很强的挥发性，建议在通风橱中进行
3.2 Total RNA提取
  1. 将上一步裂解的TRIzol混合物移到透明的1.5mL离心管中，室温孵育5min使核蛋白复合物完全解离
  2. 每1mL的TRIzol试剂中添加0.2mL氯仿，盖紧试管盖子，然后通过摇动彻底混合
Important

氯仿加进去之后，由于密度大，会沉在离心管底部，一定要进行摇匀，否则离心之后会失败

  1. 室温孵育2-3min
  2. 在 4° C 下 12,000×g 离心样本 15 分钟

混合物分离成下层的红色苯酚 - 氯仿层和以及无色的上层水相

  1. 通过45° 倾斜试管并将透明溶液吸出，将含有RNA的水相转移到新管中
Important

主要是吸取透明的上清，不能吸取白色的中间层和下面红色曾，如果吸取了可以打掉只保留透明的部分，45°或者垂直吸取都可以，也可以保留一些不必要全部抽取干净

  1. 1mLTRIzol大约能抽取0.4-0.5mL的上清液，然后加入0.5mL异丙醇
  2. 4°C或者室温孵育10min
  3. 在4°C下12,000×g离心10分钟

总RNA沉淀在试管底部形成白色凝胶状沉淀

  1. 使用移液器小心的去掉上清液
3.3 洗涤RNA
  1. 按照每1mLTRIZol试剂裂解处理所得到的沉淀重悬于75%乙醇中
  2. 短暂涡旋样本后，在在4°C下7500×g离心5分钟
  3. 使用微量移液器弃去上清液
  4. 将RNA沉淀在真空或空气下干燥5-10分钟
Important

！切勿用真空离心机干燥沉淀。切勿让RNA沉淀过度干燥。以确保RNA的完全溶解。部分溶解的 RNA样本的A230/280比值<1.6

3.4 溶解测量RNA
  1. 使用20-50 μL不含RNase的水，或者TE Buffer(官方还要加0.1mMEDTA或0.5%SDS，看自己需求)反复吹打使沉淀重新悬浮
  2. 在55-60°C的水浴或加热块中孵育10-15分钟
  3. 立即使用放置在冰浴中，或者长期保存在-70°C下
  4. 测定RNA含量和纯度。

每个仪器操作上可能有细微差别，但是总体一致，得到A260/A280, A260/A230来查看RNA的纯度和含量，更精确的定量，可以使用 Qubit

NanoPhotometer

NanoPhotometer

4. 污染判断

A260表示核酸在最高吸收峰260nm波长处的吸光度值，即260nm出核酸最容易吸收光，通过检测260nm处吸收的吸光度值可评测纯化双链DNA，单链DNA或RNA样品的浓度。

Table 2: Adsorption
波长(nm) 主要检测物质 应用
260 nm 核酸（RNA、DNA） 用于计算核酸浓度
280 nm 蛋白质（含芳香族氨基酸，如Trp、Tyr） 用于判断蛋白污染
230nm 有机物/盐类（乙醇、GTC、GuHCl、EDTA等） 用于判断有机污染物
Table 3: 判断表
比值 正常值 偏离情况 可能的污染物或原因
A260/A280 ~2.0 <1.8 蛋白质、酚类
A260/A280 >2.1 偏高可能为背景干扰或低浓度误差 仪器误差、杂质干扰
A260/A230 2.0–2.2 <1.8 GTC（异硫氰酸胍）、GuHCl（盐酸胍）、乙醇、EDTA
A260/A230 >2.4 不常见，可能为测定误差 波长设置问题或杂质吸收峰移位

在 Table 2 中就可以得到下面中常见的干扰因素，分母越大比值越小，按照常见污染物的吸收峰即可大概推测到污染物来源，Table 3 只能作为辅助，并不是绝对的。之前还根据A260/A280大于2来判断RNA是否降解，但是仅仅是经验之谈，还需要跑胶验证。

RNA的糖环比DNA多一个自由羟基，并且环境中存在大量的RNA酶，因此提取RNA很容易出现降解的情况。紫外分光光度计方法很难分辨提取的RNA是否完整，因为无论时完整的（intact RNA）还是片段化的RNA（degraded RNA）在260 nm处都会有一个吸光值

EDTA在~230 nm处有最高吸收峰，因此会降低A260/A230比值，但是当EDTA螯合Mg2+或Ca2+后，EDTA-阳离子复合物的紫外吸光度会显著低于游离EDTA，因此在含有二价阳离子的EDTA溶液中测量DNA A260/A230比值很可能超过3.0。这也是为什么pure RNA在10 mM Tris pH 8.5溶液中A260/A230比值在2.3-2.4之间，而在TE缓冲液（Tris-EDTA）中A260/A230比值在2.6-3.0之间

Note

核酸的提取仅仅是下游应用的开始，注意枪头，手，唾液，离心管和水中的核酶污染基本能控制核酸的完整性，希望都能提到纯纯的核酸，顺利进行下一步