体外3T3 NRU光毒性测试标准操作程序 (SOP)

OECD 测试指南 432

Author

基于OECD TG 432 (2019)

Published

January 29, 2026

概述

1. 目的

本标准操作程序（SOP）描述了体外3T3中性红摄取（NRU）光毒性测试方法，用于：

  • 识别经光激活的受试化学品的光毒性潜力
  • 评估化学品在光照和非光照条件下的细胞毒性差异
  • 预测化学品在体内的光毒性效应

2. 原理

体外3T3 NRU光毒性测试基于比较化学品在有光照和无光照条件下的细胞毒性：

  • 细胞毒性通过中性红（NR）摄取量的浓度依赖性降低来评估
  • 中性红（NR）是一种弱阳离子染料，可通过非离子扩散穿透细胞膜并积聚在溶酶体中
  • 光毒性机制：光毒剂通过产生活性氧（ROS）等机制导致溶酶体膜通透性增加、pH梯度降低等不可逆变化
  • 测试时间：在处理和照射后18-24小时测量NR摄取量

3. 适用范围

3.1 测试化学品类型

适用于可能诱导光毒性效应的化学品，包括：

  • 局部给药的化妆品成分
  • 系统给药后分布到皮肤/眼睛的药物
  • 可能暴露于环境光的其他化学品

3.2 不适用情况

本测试不设计用于预测：

  • 光基因毒性
  • 光过敏
  • 光致癌性
  • 间接光毒性机制
  • 代谢产物的效应
  • 混合物的效应

4. 定义

术语 定义
光毒性 局部或系统给予光反应性化学品后，身体暴露于环境光所引发的毒性反应
辐照度 紫外线（UV）或可见光入射到表面的强度，单位：W/m²或mW/cm²
光照剂量 入射到表面的紫外线（UV）或可见辐射的量（强度×时间），单位：J/cm²
UVA波段 315-400 nm
UVB波段 280-315 nm
IC₅₀ 使细胞活力降低50%的化学品浓度
PIF 光刺激因子 = IC₅₀(-Irr) / IC₅₀(+Irr)
MPE 平均光效应

材料与试剂

1. 细胞系

BALB/c 3T3细胞（克隆A31）

来源：

  • ATCC（美国模式培养物保藏中心）
  • ECACC（欧洲细胞培养物保藏中心）

质量控制：

  • 支原体检测阴性
  • 细胞代次 < 100代（优选）
  • 定期检查UV敏感性

细胞库管理：

  • 建立主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）
  • 使用液氮冷冻保存
  • 记录传代历史

2. 培养基与试剂

2.1 完全培养基

组分 浓度
DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基） 基础培养基
新生小牛血清 10% (v/v)
L-谷氨酰胺 4 mM
青霉素 100 IU/mL
链霉素 100 μg/mL

培养条件：

  • 温度：37°C
  • CO₂：5-7.5%（根据缓冲系统调整）
  • 湿度：≥95%

2.2 缓冲盐溶液

选择以下之一：

  • EBSS（Earle平衡盐溶液）
  • HBSS（Hanks平衡盐溶液）

要求：

  • 不含蛋白成分
  • 不含光吸收成分（如酚红、维生素）
  • pH稳定（避免照射50分钟期间pH升高）

2.3 中性红溶液

配制（50 μg/mL）：

  • 中性红（3-氨基-7-二甲基氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐）
  • CAS号：553-24-2
  • C.I. 50040
  • 溶解于无血清培养基

注意事项：

  • 使用前预质量控制
  • 过滤或离心去除结晶
  • 可添加HEPES防止结晶

2.4 NR提取液（现配）

  • 49%去离子水
  • 50%乙醇
  • 1%冰醋酸

3. 受试化学品制备

3.1 溶剂选择

优先顺序：

  1. 缓冲盐溶液（EBSS/HBSS）
  2. DMSO（二甲亚砜）- 最高1% (v/v)
  3. 乙醇 - 最高1% (v/v)

溶剂评估要求：

  • 与受试化学品无反应
  • 不诱导光毒性
  • 不淬灭光毒性效应
  • 无自由基清除特性
  • 化学稳定性

3.2 溶解度

  • 涡旋混合
  • 超声处理
  • 适当温度加热（不影响稳定性）

3.3 储存

  • 测试当天新鲜配制（除非稳定性数据支持）
  • 避免预先光激活或降解

4. 阳性对照

推荐：氯丙嗪（Chlorpromazine, CPZ）

参数 可接受范围
CPZ (+Irr) IC₅₀ 0.1 - 2.0 μg/mL
CPZ (-Irr) IC₅₀ 7.0 - 90.0 μg/mL
PIF > 6

其他阳性对照（见表1）：

  • 胺碘酮（Amiodarone HCl）
  • 诺氟沙星（Norfloxacin）
  • 蒽（Anthracene）
  • 原卟啉IX二钠（Protoporphyrin IX Disodium）

仪器设备

1. 细胞培养设备

设备 规格
CO₂培养箱 37°C，5-7.5% CO₂，湿度≥95%
生物安全柜 II级A2型
倒置显微镜 相差功能
96孔板组织培养处理板 无菌、透明底
血球计数板 细胞计数
离心机 细胞沉淀用

2. 光照系统

2.1 光源（太阳模拟器）

推荐类型：

  1. 氙弧灯 - 与日光匹配最佳
  2. 掺杂金属卤化物弧灯 - 产热少、成本低

光谱要求：

  • 发射完整太阳光谱：290-700 nm
  • 经过滤后衰减UVB，允许UVA和可见光透过
  • 符合ISO D65标准（国际室外日光标准）

2.2 滤光器

  • 用于衰减高度细胞毒性的UVB波长
  • 考虑96孔板盖的UV稳定剂过滤效应
  • 测量透射光谱时应使用实际使用的板盖类型

2.3 剂量测定设备

UVA计：

  • 宽带UVA计（定期校准）
  • 通过实际使用的96孔板盖类型测量辐照度

光谱辐射计（外部校准）：

  • 定期测量光谱辐照度
  • 调整UVA计校准

2.4 推荐照射参数

参数 值
UVA剂量 5 J/cm²
UVA辐照度 1.7 mW/cm²
照射时间 50分钟
温度 室温

剂量计算公式：

\[t (min) = \frac{照射剂量 (J/cm^2) \times 1000}{辐照度 (mW/cm^2) \times 60}\]

3. 分析设备

设备 规格
酶标仪/分光光度计 540±10 nm测量波长
微孔板振荡器 提取NR用
移液器 0.1-1000 μL范围
多通道移液器 96孔板操作

操作步骤

第1天：细胞铺板

步骤1：制备细胞悬液

  1. 从工作细胞库复苏细胞或从传代培养中获取细胞
  2. 用完全培养基调整细胞密度至 1 × 10⁵ cells/mL
  3. 确保细胞处于对数生长期，活力>90%

步骤2：铺板

板类型 孔内容 体积
测试化学品板（+Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
测试化学品板（-Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
阳性对照板（+Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
阳性对照板（-Irr） 100 μL细胞悬液 1×10⁴ cells/孔
周边孔（空白） 100 μL完全培养基 -

要点：

  • 每种受试化学品需要2块板（+Irr和-Irr）
  • 阳性对照需要2块板
  • 周边孔加培养基作为空白对照

步骤3：培养

  • 将96孔板置于37°C，5-7.5% CO₂培养箱
  • 培养18-24小时
  • 直至形成约50%汇合单分子层
  • 此期间细胞恢复、贴壁并指数生长

第2天：化学品处理与照射

步骤4：制备受试化学品稀释系列

几何稀释系列（8个浓度）：

  1. 确定最高测试浓度：

    • 最大浓度：≤ 1000 μg/mL
    • 许多情况下可降至100 μg/mL
    • 对于不溶性化学品：使用最高可达到浓度

  2. 使用恒定稀释因子（例如：√10或2）

  3. 配制示例：

# 假设最高浓度为1000 μg/mL，使用1:3.16稀释
concentrations <- c(1000, 316, 100, 31.6, 10, 3.16, 1, 0.316) # μg/mL
  1. 在所选溶剂中制备8个储液
  2. 将储液转移至水性载体（EBSS/HBSS）用于加样
  3. 保持最终溶剂浓度恒定（通常1% v/v）

步骤5：处理细胞

  1. 吸去培养基
  2. 轻柔洗涤：每孔加入150 μL缓冲液，吸去
  3. 加入100 μL含相应浓度受试化学品的缓冲液
  4. 溶剂对照孔：加入含相同浓度溶剂的缓冲液
  5. 在暗处培养60分钟

步骤6：光照/避光处理

光照板（+Irr）：

  1. 在室温下通过板盖照射细胞
  2. 使用5 J/cm² UVA剂量（约50分钟）
  3. 确保温度控制在室温范围

避光板（-Irr）：

  1. 在室温下保持在暗处
  2. 时间与照射板相同（约50分钟）
  3. 可用铝箔包裹或放置暗盒中

步骤7：洗涤与恢复

  1. 吸去测试溶液
  2. 用缓冲液洗涤2次（每孔150 μL）
  3. 加入100 μL新鲜完全培养基
  4. 置于培养箱过夜培养（18-24小时）

第3天：中性红摄取测定

步骤8：显微镜检查

使用相差显微镜检查：

  • 细胞形态：观察形态学变化
  • 单分子层完整性：检查是否有脱落或空洞
  • 细胞生长：评估生长密度
  • 异常：记录任何异常现象

步骤9：中性红摄取

  1. 预温育缓冲液至37°C
  2. 吸去培养基，用150 μL温育缓冲液洗涤细胞
  3. 吸去缓冲液
  4. 加入100 μL中性红溶液（50 μg/mL，无血清培养基）
  5. 在37°C、5-7.5% CO₂条件下培养3小时

步骤10：洗涤与提取

  1. 吸去中性红培养基
  2. 用150 μL缓冲液洗涤细胞
  3. 吸去缓冲液，彻底去除残留液体（可倒扣在纸巾上或离心）
  4. 加入精确150 μL NR提取液
  5. 在微孔板振荡器上温和振荡至少10分钟
  6. 直至NR完全提取且溶液均匀

步骤11：吸光度测定

  1. 在540±10 nm波长下测量吸光度
  2. 使用空白孔（周边孔）作为参考
  3. 将数据保存为适当的电子文件格式以便后续分析

数据分析

1. 数据质量要求

1.1 接受标准

溶剂对照：

  • 照射的溶剂对照活力应 > 非照射溶剂对照的80%
  • 溶剂对照的平均OD₅₄₀ ≥ 0.4（约为背景溶剂吸光度的20倍）

阳性对照（氯丙嗪）：

  • CPZ (+Irr) IC₅₀：0.1 - 2.0 μg/mL
  • CPZ (-Irr) IC₅₀：7.0 - 90.0 μg/mL
  • PIF > 6

细胞生长：

  • 1×10⁴ cells/孔应在48小时内正常倍增

1.2 数据点要求

  • 捕获有光照和无光照条件下的浓度-响应关系
  • 如可能，确定IC₅₀值
  • 包括在50%活力上下的浓度点

2. 细胞活力计算

\[相对活力(\%) = \frac{OD_{测试} - OD_{空白}}{OD_{溶剂对照} - OD_{空白}} \times 100\]

3. 浓度-响应曲线拟合

  • 使用适当的连续浓度-响应曲线（模型）近似离散数据
  • 通过非线性回归方法进行拟合
  • 推荐使用bootstrap程序评估数据变异性的影响

4. 光毒性指标计算

4.1 光刺激因子（PIF）

\[PIF = \frac{IC_{50}(-Irr)}{IC_{50}(+Irr)}\]

说明：

  • IC₅₀(-Irr)：无光照条件下使活力降低50%的浓度
  • IC₅₀(+Irr)：有光照条件下使活力降低50%的浓度
  • 如无法计算任一IC₅₀，则无法确定PIF

4.2 平均光效应（MPE）

MPE基于完整浓度-响应曲线的比较：

\[MPE = \frac{\sum_{i=1}^{n} w_i \cdot PE_{c_i}}{\sum_{i=1}^{n} w_i}\]

其中： - \(PE_c\) = 光效应 = \(RE_c \times DE_c\) - \(RE_c\)（响应效应）= \(R_c(-Irr) - R_c(+Irr)\) - \(DE_c\)（剂量效应）= \(\frac{C/C^*-1}{C/C^*+1}\) - \(w_i\)（权重因子）= \(\max\{R_i(+Irr), R_i(-Irr)\}\)

4.3 软件工具

OECD秘书处提供PIF和MPE计算软件包：

  • PhotoTox version 2.0
  • 网址：http://www.oecd.org/env/ehs/testing/section4software.htm

5. 结果解释

5.1 判读标准（基于验证研究）

PIF MPE 预测
< 2 < 0.1 无光毒性
> 2 且 < 5 > 0.1 且 < 0.15 可疑光毒性
> 5 > 0.15 光毒性

5.2 特殊考虑

仅在最高浓度观察到光毒性效应时：

  • 评估皮肤吸收数据
  • 评估化学品的皮肤蓄积
  • 考虑其他测试（如ROS试验）
  • 进行体外动物或人体皮肤试验或皮肤模型测试

可疑/边界/不清楚的结果：

  • 通过进一步测试澄清
  • 考虑修改实验条件：
    • 浓度范围或间距
    • 培养时间
    • 照射时间（对于水不稳定性化学品可使用更短时间）

质量控制

1. 细胞质量控制

1.1 支原体检测

  • 细胞到达实验室时检测
  • 仅当阴性时使用

1.2 UV敏感性检查

  • 对工作细胞库至少检查一次
  • 在最高使用代次进行测试
  • 使用递增剂量照射（包括高于测试使用的剂量）
  • 证明最高非细胞毒性剂量（5 J/cm²）足以正确分类能力验证化学品

1.3 历史数据

  • 建立阳性对照的MPE历史数据库
  • 监测实验性能随时间的变化

2. 仪器质量控制

2.1 光源

  • 每次测试前使用UVA计检查辐照强度
  • 通过实际使用的板盖类型测量
  • 定期使用外部校准的光谱辐射计

2.2 培养箱

  • 每日记录温度和CO₂浓度
  • 定期清洁和校准

2.3 酶标仪

  • 定期校准波长和吸光度准确性
  • 使用标准溶液验证

4. 能力验证

初次建立本实验的实验室应测试能力验证化学品（表1）：

化学品 CAS号 预期PIF 预期MPE 光毒性
胺碘酮HCl 19774-82-4 >3.25 0.27-0.54 是
氯丙嗪HCl 69-09-0 >14.4 0.33-0.63 是
诺氟沙星 70458-96-7 >71.6 0.34-0.90 是
蒽 120-12-7 >18.5 0.19-0.81 是
原卟啉IX二钠 50865-01-5 >45.3 0.54-0.74 是
L-组氨酸 70-00-4 <1 0.05-0.10 否
六氯酚 70-30-4 1.0-1.7 0.00-0.05 否
十二烷基硫酸钠 151-21-3 1.0-1.9 0.00-0.05 否

测试报告

测试报告应包括以下信息：

1. 受试化学品

  • 识别数据、通用名、IUPAC名和CAS号（如已知）
  • 物理性质和纯度
  • 与研究相关的物理化学性质
  • UV/vis吸收光谱
  • 稳定性和光稳定性（如已知）

2. 溶剂

  • 选择溶剂的理由
  • 受试化学品在溶剂中的溶解度
  • 处理培养基中溶剂的百分比

3. 细胞

  • 细胞类型和来源
  • 无支原体和其他污染
  • 细胞传代代次
  • 使用照射设备测定的特定代次范围细胞的辐射敏感性

4. 测试条件（1）：处理前和处理后培养

  • 培养基类型和组成
  • 培养条件（CO₂浓度、温度、湿度）
  • 培养持续时间（处理前、处理后）

5. 测试条件（2）：化学品处理

  • 选择有光照和无光照条件下受试化学品浓度的理由
  • 受试化学品溶解度有限且无细胞毒性时：选择最高测试浓度的理由
  • 处理培养基类型和组成（缓冲盐溶液）
  • 化学品处理持续时间

6. 测试条件（3）：照射

  • 选择所用光源的理由
  • 光源制造商和类型、辐射计
  • 光源光谱辐照度特性
  • 所用滤光器的透射和吸收特性
  • 辐射计特性及其校准详情
  • 光源与测试系统的距离
  • 该距离下的UVA辐照度（mW/cm²）
  • UV/vis光暴露持续时间
  • UVA剂量（辐照度×时间，J/cm²）
  • 照射期间和同期暗处保存的细胞培养温度

7. 测试条件（4）：中性红活力测试

  • 中性红处理培养基组成
  • 中性红培养持续时间
  • 培养条件（CO₂浓度、温度、湿度）
  • 中性红提取条件（提取剂、持续时间）
  • 分光光度计读数波长
  • 第二波长（参考）（如使用）
  • 酶标仪空白内容（如使用）

8. 结果

  • 受试化学品各浓度下的细胞活力，表示为平均同时溶剂对照活力的百分比
  • 同时进行的+Irr和-Irr实验获得的浓度-响应曲线
  • 浓度-响应曲线分析：如可能，计算IC₅₀(+Irr)和IC₅₀(-Irr)
  • 比较有光照和无光照条件下获得的两条浓度-响应曲线：
    • 通过计算光抑制因子（PIF）
    • 和/或通过计算平均光效应（MPE）（取决于剂量-响应曲线）
  • 测试接受标准；同时溶剂对照：
    • 照射和非照射细胞的绝对活力（中性红提取物的光密度）
    • 历史阴性和溶剂对照数据；均值和标准差
  • 测试接受标准；同时阳性对照：
    • 阳性对照化学品的IC₅₀(+Irr)和IC₅₀(-Irr)及PIF/MPE
    • 历史阳性对照化学品数据：IC₅₀(+Irr)和IC₅₀(-Irr)及PIF/MPE；均值和标准差

附录

附录A：测试流程图

flowchart TD
    A[第1天：细胞铺板] --> B[18-24 h培养<br/>形成50%汇合单层]
    B --> C[第2天：化学品处理]
    C --> D[60分钟暗培养]
    D --> E{分板}
    E --> F[+Irr板：<br/>5 J/cm² UVA照射50分钟]
    E --> G[-Irr板：<br/>室温暗处50分钟]
    F --> H[洗涤 + 新鲜培养基]
    G --> H
    H --> I[18-24 h恢复培养]
    I --> J[第3天：中性红摄取测定]
    J --> K[3小时NR培养]
    K --> L[提取 + 测定OD540]
    L --> M[数据分析：<br/>计算PIF/MPE]
    M --> N[结果判读]

附录B：决策树 - 光毒性测试策略

flowchart TD
    A[评估化学品<br/>物理化学性质] --> B{UV/vis吸收光谱}
    B -->|MEC < 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹| C[无需光毒性测试]
    B -->|MEC > 1000 L mol⁻¹ cm⁻¹| D[体外3T3 NRU光毒性测试]
    D --> E{PIF < 2 或 MPE < 0.1}
    E -->|是| F[无光毒性]
    E -->|否| G{PIF > 5 或 MPE > 0.15}
    G -->|是| H[光毒性]
    G -->|否| I[可疑光毒性<br/>需进一步评估]

附录C：阳性对照试剂准备

氯丙嗪（Chlorpromazine）储液制备

1 mg/mL储液（在DMSO中）：

  1. 精确称取10 mg氯丙嗪
  2. 加入10 mL DMSO
  3. 涡旋混合直至完全溶解
  4. 分装至小体积，避光保存于-20°C

工作液制备：

  • 在EBSS/HBSS中稀释至所需浓度范围
  • 保持最终DMSO浓度恒定为1% (v/v)

附录D：记录表格模板

测试记录表

项目 记录
测试日期
操作员
受试化学品
批号
溶剂
细胞系 BALB/c 3T3
细胞代次
铺板密度 1×10⁴ cells/孔
光源类型
UVA辐照度 mW/cm²
照射时间 min
UVA剂量 J/cm²

版本历史

版本 日期 修订内容 修订人
1.0 2024-01-XX 基于OECD TG 432 (2019)创建初版 -