Abstract
尽管贻贝足丝蛋白的粘合性和粘结性长期以来一直启发人们设计体现这些特性的材料，但其特有的氨基酸组成表明，这类蛋白可能还能够启发另一种尚未与其相关联的材料功能。此文章证实来自贻贝粘蛋白足蛋白-5 mfp-5,一个贻贝粘附在关键蛋白，展示出来之前未曾报道的活性。这种神秘的功能启发了我们设计一种新型的肽基抗菌粘合水凝胶，能够有效抑制革兰氏阳性菌。凝胶显示出来两种机制：表面接触膜破坏和材料产生的H2O2对氧化杀灭的影响。通过对氨基酸组成和序列与材料机械粘附/内聚力和抗菌活性的详细研究，得到了 MIKA2 粘合凝胶，一种具有优异活性的材料，已被证明可以抑制小鼠体内钛植入物的定植。
Introduction
大自然不断激发具有迷人特性的高性能新材料的开发。比如，猪笼草捕获昆虫猎物的机制启发了仿生滑液注入多孔表面Slippery Liquid-Infused Porous Surfaces。
- 先制造一个具有微观多孔结构或粗糙纹理的固体表面
- 然后在其上注入一层与水不混溶的润滑液体（如氟油），润滑液被毛细作用固定住。
- 表面因此变得极其光滑且稳定，就像猪笼草唇缘上的水膜一样。
黑色素是负责人类多种功能的色素，它启发了聚合肽色素的设计。软体动物壳中的珍珠层启发了抗冲击透明材料的设计。尽管贻贝粘蛋白已经被研究很久，但是更近距离的研究分子机制能够得到更多的启发。
用短肽（peptides）自组装形成类似黑色素的功能性纳米材料，称为聚合肽色素（peptide-based pigment）或仿黑色素材料（melanin-mimetic materials）
珍珠层具有坚硬材料的刚性和柔软材料的耐用性，它由坚硬的粉笔状物质制成，上面覆盖着高弹性的软蛋白质。这种结构产生了非凡的强度，使其比构成它的材料坚固 3000 倍。
贻贝足蛋白-5（Mfp-5）是一种分布在足丝-基质界面的界面蛋白，具有很强的粘附性。Mfp-5 的一级序列含有大量赖氨酸以及非编码的 3,4 二羟基-L-苯丙氨酸 (DOPA) 氨基酸，多巴胺的还原儿茶酚形式主要通过参与与底物的各种物理相互作用（包括金属络合、π-π堆积和氢键）来实现表面粘附。
DOPA基团可以简化成儿茶酚加一个丙氨酸；也可以是酪氨酸使用酪氨酸酶羟基化。赖氨酸可以在粘附中发挥协同作用，例如，通过从矿物表面驱逐水合阳离子，为多巴胺结合提供干燥的斑块。 多巴的氧化醌形式在材料内聚力中起着重要作用，在自由基芳基-芳基偶联和席夫碱以及与亲核残基（如赖氨酸）的迈克尔型反应中起着重要作用。
自由基芳基-芳基偶联（radical aryl-aryl coupling）:多巴醌上的芳香环在酚氧自由基形式下，可以与另一芳香环发生 C–C 或 C–O 芳基自由基耦合，形成二聚体或聚合物。
席夫碱反应（Schiff base reaction）: 多巴氧化后生成的醌基（C=O）可以与伯胺（如赖氨酸ε-氨基）发生缩合反应，形成亚胺（Schiff base，C=N）结构。
迈克尔加成反应（Michael-type addition）:多巴醌具有α,β-不饱和酮结构，可被亲核基团（如硫醇、胺）通过1,4-加成攻击，形成共价连接。
Mfp-5（肌足粘附蛋白5）中赖氨酸含量很高，这与抗菌肽中赖氨酸残基高频出现的现象非常相似，通过破坏细菌壁发挥其作用。此外，据报道，包括多巴胺在内的儿茶酚会自氧化，生成过氧化氢 (H2O2)，因此DOPA和赖氨酸的整合或许有抗菌活力。尽管矫形假肢、牙科植入物和心脏装置等设备彻底改变了现代医学，但它们也带来了很大的感染风险。
Results and discussion
A peptide derived from Mfp-5 produces peroxide and displays antibacterial activity
为了验证mfp-5中赖氨酸和DOPA残基有抗菌活性，在天然蛋白中确认了氨基酸序列其中富含这两个残基。文中呈现了Mfp-529-47DOPA,参照对比肽是Mfp-529-47。所有的多肽是使用Fmoc固相肽合成，使用反向LC进行纯化，主要结构使用LC-MS进行测定。
Fmoc-based solid phase peptide synthesis: 以 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) 为氨基保护基，利用固相载体逐步构建多肽链。
Figure 1 显示出DOPA多肽可以生成H2O2和多肽浓度相关，产生浓度高达0.5mM，相反赖氨酸多肽未产生H2O2，表明DOPA是产生过氧化物必要的。然后，我们通过肉汤微量稀释法检测了这些肽对临床相关的革兰氏阳性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 菌株的抗菌活性，这些菌株对万古霉素的敏感性降低。
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA），即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，是一种对多种常用抗生素具有抗药性的细菌株，是医院内外感染的重要病原体。
Figure 1 中Mfp-529-47显示DOAP多肽抗菌最小抑菌浓度MIC 250μg/mL, 24小时后能够产生大量H2O2的肽浓度。值得注意的是，直接添加 H2O2 后，MRSA 在浓度低于 250 μM 时就被完全杀死。因为微生物增殖和H2O2产生需要时间，需要更多的过氧化物来杀死在测定孵育时间内产生的增加的细菌数量。对照的赖氨酸多肽也能抑制抗性菌生长，同样，赖氨酸等带正电荷的残基对于许多阳离子抗菌肽的活性至关重要，这些肽会在溶解细胞的过程中破坏细菌膜。构建了镜像多肽DMfp-529-47,该肽还表现出对抗 MRSA 的活性，表明其作用机制是非立体特异性的，并且本质上可能是膜溶解性的。正如脂质体模型中，多肽能够选择性带负电的脂质体。Mfp-529–47DOPA（250 μg/mL）和 Mfp-529–47 Tyr（500 μg/mL）的 MBC(Minimum bactericidal concentration) 值与MIC值一致，表明具有杀菌活性。
Design and biophysical characterization of an adhesive antibacterial hydrogel
开发了一款粘合水凝胶能够使用注射器直接注射到设备表面做表涂层，以及在植入过程中对组织的抗菌作用，为外科医生提供了最大的灵活性，可以决定粘合剂在手术部位的区域局部抗菌效果。因此，凝胶需要具有剪切稀化/恢复流变特性，以便注射，放置后具有粘性，并能够杀死细菌
- Shear-thinning（剪切变稀）:当施加剪切力（如搅拌、挤压、涂抹）时，材料的粘度降低，变得更容易流动。
- Recovery（恢复性）:剪切停止后，材料的内部结构可以在短时间内自我重建，从而恢复初始的粘度或弹性。
常规的策略就是将Mfp-529-47DOPA 肽连接到具有所述机械性能的聚合物支架上。虽然这个过程本身看起来很直接或操作简单，但却很难控制材料中 DOPA（多巴）和赖氨酸（lysine）这两种基团在材料表面或结构中出现的相对位置、比例、分布或可接近性，可能对材料的机械性能（如强度、柔韧性）和抗菌性能具有重要影响。相反，肽自组装被用于生成纤维状凝胶，这些水凝胶的基本单元——即组成纤维的肽——可以被区域特异性地（regiospecifically）展示出大量的赖氨酸和DOPA残基。
这些肽分子能在特定触发条件（triggered）下自发组装（self-assembly），自组装过程的结果是形成纤维状水凝胶（fibrillar gels）。Solid-State NMR，简称SSNMR显示这些肽链组装形成了一个双层的交叉β结构（bilayered cross β-structure）肽链折叠成了两性 β-发夹构象(β-hairpin)。
固体核磁共振（Solid-State NMR，简称SSNMR）是一种用于分析固态物质结构和技术特性的核磁共振技术；与液体核磁共振不同，SSNMR主要研究固体样品
每个发夹结构含有两条 β 链，由四残基的回转（-VDPPT-）连接。在 β 链内，氨基酸侧链投射到发夹主链骨架的上方和下方，发夹疏水面上的氨基酸与水隔离，并负责双层的形成。可以使用基于结构的方法来设计在凝胶材料内沿纤维区域特异性地显示 DOPA 和赖氨酸侧链的肽。
Figure 2 设计了三种肽，它们均含有相同的反转序列，并且在其各自的疏水 β 链位置上均掺入了缬氨酸。然而，肽 M1DOPA1 在位置 15 的亲水面上含有一个 DOPA 残基，其余每个位置上都含有赖氨酸残基。M1DOPA2 肽在 C 端（位置 19）附近含有单个 DOPA，这使得残基位于纤维边缘，处于溶剂暴露较多的区域，周围赖氨酸残基较少。这两种肽有助于确定多巴和赖氨酸对材料内聚力、粘附力、过氧化物生成和抗菌活性的位置效应。MIKA2 肽保留了位置 19 处的 DOPA，但将位置 6 和 17 处的两个赖氨酸残基替换为精氨酸。已知将精氨酸加入富含赖氨酸的抗菌肽中可以提高其效力。最后，制备对照肽，用酪氨酸代替每种肽的 DOPA 残基，以描述其对材料性质的影响。
Figure 2 结果表明，在生理条件下（pH 7.4、37°C），所有肽都能组装成自支撑凝胶，且含 DOPA 的凝胶呈现红色。这些凝胶的其中一个吸引人的特点是其易于制备，首先将肽溶于水，然后加入缓冲盐水（pH 7.4）。将所得溶液吸入注射器，在 37°C 下孵育至完全凝胶化。凝胶可通过注射器直接注射给药。圆二色性（CD）光谱表明，肽在最初溶解于水中时是非结构化的，由于质子化的赖氨酸/精氨酸残基导致肽间电荷排斥，使肽保持非结构化和可溶解性。通过添加缓冲液来启动自组装，缓冲液会提高溶液的pH值和离子强度。然而，在室温下凝胶化速度较慢，溶液会被吸入注射器。将溶液加热至 37°C，通过疏水效应加速肽组装，从而形成富含 β 折叠二级结构的纤维网络。
圆二色（Circular dichroism 简称 CD）光谱是研究蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。在蛋白质和多肽分子中，肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键是主要的光活性生色基团。当平面圆偏振光通过时，这些生色基团对左右圆偏振光的吸收不同，造成偏振光矢量的振幅差，使得圆偏振光变成了椭圆偏振光， 就产生了蛋白质的圆二色性。
透射电子显微镜 (TEM) 显示，从含有多巴和酪氨酸的凝胶中分离出的纤维的局部形态相似，纤维宽度为 3-4 纳米，与折叠的 β-发夹肽的宽度相对应。
Mechanical properties and cytocompatibility of antibacterial adhesive hydrogels
具有更强内聚力的材料表现出更高的机械刚度，而 DOPA 对我们水凝胶系统刚度的影响是显著的。Figure 3 结果表明，每种含 DOPA 的水凝胶的平均储能模量 (G’) 至少是酪氨酸对照凝胶的两倍,硬度可高达九倍。酪氨酸对照凝胶 (0.5 wt%) 的平均储能模量不超过 158 Pa，而含 DOPA 凝胶的 G’ 范围为 370 至 1000 Pa 以上。 DOPA 氧化导致醌的形成，醌可以与邻近的赖氨酸和其他醌发生交联反应，从而使凝胶网络变硬。DOPA 氧化生成醌时，会伴随等摩尔 H2O2 的形成。Figure 3 结果表明，最大粘合应力值在 1-2 kPa 之间变化，与我们实验室测量的临床使用的纤维蛋白胶相似,同样表明粘合凝胶的溶血潜力非常低，类似于组织培养处理的聚苯乙烯（TCTP）控制表面。
